اطلاعیه

بررسی اکوتیپ های مختلف گیاه Allium hirtifolium از دیدگاه مولکولی (با نشانگر RAPD) و مورفولوژیکی و فیتوشیمیایی(آلیسین)

کد محصول DM56

تعداد صفحات: ۱۰۰ صفحه فایلWORD

قیمت: ۱۲۰۰۰ تومان

فهرست

تقدیم به         ۴

چکیده  ۸

نتایج حاصل از بررسی مولکولی RAPD   ۱۰

فصل اول         ۱۱

مقدمـه ۱۱

فصل دوم         ۱۴

گیاهشناسـی    ۱۴

۲-۱- گیاهشناسی Allium hirtifolium         ۱۵

۲-۴- موارد مصرف A.hirtifolium      ۱۷

۲-۸-۱- Allium         ۲۱

۲- ۹- مراحل نمو در آلیومها      ۲۲

۲-۹-۵-۳ -کشت بافت در آلیومها         ۲۹

۲-۱۱ -بررسی تنوع ژنتیکی و عوامل ایجاد تنوع   ۳۱

۲-۱۲- مراکز تنوع جنس Allium        ۳۴

فصل سوم        ۳۸

بررسی مولکولی به کمک نشانگر RAPD  ۳۸

۳-۱- نشانگر چیست؟    ۳۹

۳-۲- کاربردهای نشانگرهای مولکولی      ۳۹

۳-۳-انواع نشانگرها (۱۵)          ۴۰

۳-۴- نشانگر RAPD (DNA چند شکل تکثیر شده تصادفی)   (۱۵ )       ۴۰

۳-۴-۲- تجزیه داده های RAPD  (۱۵)  ۴۳

۳-۴-۳-۱- کیفیت و کمیت DNA        ۴۳

۳-۴-۳-۲- آلودگی بیولوژیک     ۴۴

۳-۴-۱-۸- مدت زمان بسط یا توسعه طویل شدن (Extention)  ۴۵

۳-۵- مزایای RAPD     ۴۵

۳-۶- معایب نشانگرهای RAPD  ۴۵

۳-۷- کاربرد نشانگر RAPD در تحقیقات در جنس آلیوم   ۴۶

فصل چهارم      ۴۸

نشانگرهای مورفولوژیک  ۴۸

۴-۱- مزایای نشانگرهای مورفولوژیکی (۱۵)        ۴۹

۴-۲- معایب نشانگرهای مورفولوژیکی (۱۵)        ۴۹

۴-۳- مقایسه مورفولوژیک آلیومها          ۴۹

۴-۷-۲- گروههای ریزوم دار      ۵۰

۴-۷-۳- گونه های آلیوم خوراکی          ۵۰

۴-۴ -کاربرد نشانگرهای مورفولوژیک در جنس الیوم        ۵۱

۴-۵-۱- برگ و نشاء ها  ۵۳

۴-۵-۲- ساقه گلدهنده(۲۱)      ۵۴

فصل پنجم       ۵۵

بررسی فیتوشیمیایی     ۵۵

۵-۱- تاریخچه استفاده از آلیومها در تغذیه و درمان بیماریها         ۵۶

۵-۲- ترکیبات شیمیایی موجود در گیاهان جنس آلیوم    ۵۶

۵-۵- روشهای تجزیه و شناسایی اجزاء تشکیل دهنده اسانس و عصاره های استخراج شده از گیاهان ۵۸

۵-۵-۲- کروماتوگرافی لایه نازک(TLC)   ۵۹

۵-۵-۴- گاز کروماتوگرافی        ۵۹

۵-۵-۷- رزونانس مغناطیسی هسته (NMR)      ۶۱

۵-۵-۸- گاز کروماتوگرافی توام با طیف سنجی جرم(GC-Mass)  ۶۱

فصل ششم       ۶۳

مواد و روشها     ۶۳

۶-۱- نمونه های گیاهی ۶۴

(جدول ۶-۱)-مناطق جمع اوری نمونه های گیاهی         ۶۴

۶-۲- دستگاههای مورد استفاده  ۶۵

جدول(۶-۲)-  وسایل و دستگاههای مورد استفاده دربررسیهای مولکولی وفیتوشیمیایی       ۶۶

۶-۳- مواد مورد استفاده ۶۶

۶-۴- روشها     ۶۸

۶-۴-۱-   ارزیابی مورفولوژیکی   ۶۸

(جدول۶-۴-۲-۴)- پرایمرهای مورد استفاده        ۷۲

فصل هفتم       ۷۸

نتایج و بحث     ۷۸

۷-۱- گروهبندی اکوتیپها با نشانگر RAPD        ۷۹

شکل    ۷-۱ (الف ) . الگوی باندی تکثبر شده DNA 8 نمونه Allium hirtifolium با استفاده از آغازگر ۲۶۵ .      ۸۰

شکل۷-۱ (ب ).  الگوی باندی تکثبر شده DNA 8 نمونه Allium hirtifolium با استفاده از آغازگر ۲۶۵.(نمونه های شماره  ۹ تا ۱۶)     ۸۱

جدول(۷-۱ ). چند شکلی و تعداد ژنوتیپهای جدا شده توسط اغازگرها      ۸۲

جدول ۷-۲ (الف). تجزیه واریانس ۸۴

نمودار ( ۷-۲ ).روابط خویشاوندی  اکوتیپ های مختلف  Allium hirtifolium  بر اساس صفات مورفولوژیک.        ۸۶

جدول( ۷-۳ ). مقدار آلیسین اندازه گیری شده در اکوتیپهای مختلف        ۸۸

۷-۴- مقایسه داده های RAPD و مورفولوژیکی    ۸۹

جدول( ۸-۴)-همبستگی صفات مورفولوژیک و الیسین     ۹۱

فهرست منابع    ۹۳

اختصارات        ۱۰۰

چکیده

    بیش از ۱۳۹ گونه آلیوم در ایران گزارش شده اند که حدود ۳۰ گونه آن بومی خود ایران هستند . در این میان Allium hirtifolium به لحاظ اینکه تاکنون تحقیقاتی از لحاظ مولکولی و یا مورفولوژیکی بر  روی آن انجام نشده و تعداد تحقیقاتی که در مورد این گونه خاص در دنیا انجام گردیده, به لحاظ کمی بسیار اندک می باشد, لذا بر آن شدیم تا با جمع آوری این گیاه از نقاط اصلی رویش ان که عمدتا مناطق مرکزی ایران و خصوصاً استان لرستان است, به بررسی ابعاد مولکولی و مورفولوژیکی و فیتوشیمیایی آن بپردازیم. بررسی های ما بر روی این گونه شامل بخش های زیر می باشد:

بخش اول: جمع آوری و نگهداری مواد گیاهی

ابتدا، نمونه های گیاهی از شانزده منطقه مختلف استان لرستان جمع آوری و در مرحله بعد مرکز تحقیقات منابع طبیعی استان لرستان و همچنین پژوهشکده علوم گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه فردوسی تعیین هویت گردید و سپس غده ها تا انجام آزمایشات بعدی در یخچال و دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شدند.

بخش دوم: بررسی مزرعه ای

غده های آلیوم در آذرماه ۱۳۸۴ در مزرعه تحقیقاتی دانشکده کشاورزی دانشگاه فردوسی مشهد در سه تکرار، در هر ردیف ۴ غده از هر اکوتیپ خاص به طور تصادفی انتخاب و سپس با فاصله ۲۰ سانتی متر روی ردیف و ۳۵ سانتی متر بین ردیف کشت شدند.

پس از رویش از سطح خاک، اطلاعات مورفولوژیکی از قبیل طول برگ، عرض برگ، ارتفاع ساقه گلدهنده، تعداد برگ، وزن متوسط غده ها در بوته، تعداد غده در بوته، مدت زمان کاشت تا سبز شدن و مدت زمان کاشت تا گل دهی، در هر بوته اندازه گیری شدند.

بخش سوم: بررسی مولکولی با تکنیک RAPD

الف) کشت در گلخانه: در فروردین ماه ۱۳۸۵ تعداد دو غده از هر اکوتیپ به طور تصادفی انتخاب و در گلخانه دانشکده کشاورزی دانشگاه فردوسی مشهد، در گلدان کشت شدند و پس از رویش از سطح خاک و پس از حدود ۱۰ روز برگهای جوان چیده شده و سریعاً در داخل یخ به آزمایشگاه بیوتکنولوژی پژوهشکده بوعلی محل انجام آزمایشات مولکولی، منتقل گردید و در فریزر و در دمای ۲۰- درجه سانتیگراد تا زمان انجام آزمایش نگهداری شد.

ب) استخراج DNA : با روش Doyle and Doyle یا Hot CTAB ، DNA ها استخراج و پس از استخراج با دستگاه UVTECH، مشاهده گردیده و عکس برداری شدند. با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتری کیفیت DNA بررسی شد و نسبت جذب ۲۸۰/۲۶۰ اکثر DNA ها بین ۲-۸/۱ بودند که نشان از کیفیت خوب DNA استخراج شده از لحاظ عدم آلودگی به پروتئین و یا DNA و پلی ساکاریدها و … بود.

ج) PCR : با کمک ۲۰ آغازگر ساخت دانشگاه بریتیش کلمبیا که ۱۶ تا از آنها چند شکلی خوبی نشان دادند و براساس روش آدامز (۱۹۹۸),PCR انجام گردید و پس از الکتروفورز  ژل اگارز ۵/۱ درصد و عکسبرداری از ژل ها ، با نرم افزار(NTSYS 2/02) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفته و براساس الگوریتم UPGMA دندروگرام رسم گردید.

بخش چهارم: بررسی فیتوشیمیایی

از آنجا که اکثر ترکیبات شیمیایی آلیوم ها ترکیبات گوگردی بوده و چیزی حدود ۷۰ % این ترکیبات را هم آلیسین تشکیل می دهد لذا بررسی فیتو شیمیایی بر روی درصد آلیسین در اکوتیپ های مختلف انجام گردید و عصاره موجود در غده های گیاهان به روش بریتیش فارماکوپه, با مقداری تغییرات استخراج و با روش کاهش جذب در طول موج ۳۲۴ نانومتر و پس از اختلاط با ماده ای به نام۴ – مرکاپتو پیریدین میزان آلیسین اندازه گیری شد.

نتایج حاصل از بررسی مورفولوژیک

پس از ترسیم دندروگرام با کمک نرم افزار SAS شش گروه مختلف مورفولوژیک بدست آمد که تنوع موجود در آنها ارتباط زیادی با تنوع جغرافیایی نداشت. تجزیه واریانس و آزمون دانکن، اختلاف معنی داری را در بین بعضی صفات در اکوتیپ ها نشان داد.

نتایج حاصل از بررسی مولکولی RAPD

 در مجموع از ۲۰ آغازگر استفاده شده، ۱۶ تا چند شکلی بسیار بالایی را نشان دادند.درصد چند شکلی تمام آنها بالای ۹۰% برآورد گردید و مشخص شد که تمام آنها از کارایی بالایی در تشخیص ژنوتیپ های مختلف برخوردار هستند. بررسی دندروگرام حاصل از ماتریس ۰ و ۱ ، اکوتیپ ها را در هر ۸ گروه مختلف قرار داد. در این بررسی ارتباط زیادی بین گروه بندی مولکولی و جغرافیایی یافت نگردید.

نتایج حاصل از بررسی فیتوشیمیایی

میزان آلیسین در اکوتیپ ها با هم تفاوت داشت و از ۶۱ /۰ تا ۶۳/۳ میلی گرم آلیسین در هر گرم غده تازه متفاوت بود.میزان آلیسین با بعضی صفات مورفولوژیک از قبیل وزن غده همبستگی مثبت داشت. از مقایسه نتایج بدست آمده چنین استنباط می شود که تنوع ژنتیکی در میان اکوتیپ ها زیاد بوده بطوریکه حتی در اکوتیپ های یک منطقه نیز این مسئله وجود دارد و علت این تنوع زیاد ژنتیکی ممکن است عواملی از قبیل جهش های ژنی و نیز روش های تولید مثل جنسی باشد که البته این مسئله نیاز به بررسی بیشتری دارد.

در این بررسی مهمترین روش تشخیص چند شکلی و اختلافات ژنتیکی میان اکوتیپ ها استفاده از نشانگر RAPD بود. این روش هم روشی ساده و هم دقیق است و قادر به شناسایی اختلافات کوچک ژنتیکی می باشد.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

Time limit is exhausted. Please reload the CAPTCHA.